07月19 【成功案例】雞中腹部前脂肪細(xì)胞分化過程中l(wèi)ncRNA和mRNA表達(dá)的全基因組分析

Genome-Wide Analysis of lncRNA and mRNA Expression During Differentiation of Abdominal Preadipocytes in the Chicken

PMID:?28108554

雜志：G3 (Bethesda)

影響因子：2.861

 

研究背景：腹部脂肪是肉雞的重要胴體性狀。選育過程中對雞快速生長率的過分強(qiáng)調(diào)導(dǎo)致了過多的脂肪堆積，過量的脂肪沉積導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率、胴體產(chǎn)量、產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率降低。因此，腹部脂肪含量較低成為肉雞的主要育種目標(biāo)。脂肪細(xì)胞生成是受多種轉(zhuǎn)錄事件調(diào)節(jié)的一個(gè)復(fù)雜過程，近期的一些研究通過全基因組范圍內(nèi)的mRNA?(Ji et al.?2012；Regassa and Kim 2015)和microRNA?(Wang et al.?2015)分析，探索了雞脂肪生成的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。但是目前對脂肪生成的調(diào)節(jié)機(jī)制知之甚少。此外，長鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)節(jié)脂肪形成和其他與代謝組織發(fā)育和功能相關(guān)的過程，但是雞體內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化期間lncRNAs的功能和特征尚不清楚。

材料方法：

1.實(shí)驗(yàn)材料：

取14日齡京海黃雞，無菌條件下分離4g腹部脂肪組織。剪碎組織、膠原酶I消化并分離基質(zhì)血管組分后，利用DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在35℃和5% CO₂的條件下培養(yǎng)至90%匯合度。分別誘導(dǎo)分化0、48、96和144 小時(shí)后取樣進(jìn)行RNA-seq，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.測序方法及數(shù)據(jù)量：

RNA-seq，Illumina XTen.?從12個(gè)樣本總共獲得了1,300,074,528 clean reads?(195.02 Gb)。

技術(shù)路線：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 測序結(jié)果和質(zhì)量控制

分離培養(yǎng)腹部前脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化48小時(shí)、96小時(shí)和144個(gè)小時(shí)后取樣進(jìn)行RNA-seq，未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞（0小時(shí)）作為對照。對12個(gè)樣本的文庫進(jìn)行測序得到1,300,074,582 (195.02 Gb)?clean reads。每個(gè)樣本的Q30都在92.81%以上，平均GC含量為52.51%，12個(gè)樣本的比對率在79.40和84.30%之間。

2. 前脂肪細(xì)胞lncRNA及其功能預(yù)測

經(jīng)篩選獲得了27,023個(gè)新的lncRNA?；趌ncRNA順式作用功能鑒定了4915個(gè)靶基因。進(jìn)一步通過GO分析發(fā)現(xiàn)總共有1746、1544和2174個(gè)基因分別被富集到生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)GO條目內(nèi)。KEGG富集分析顯示917個(gè)基因被顯著富集到包括Wnt、MAPK和血管平滑肌收縮通路中。

3. 腹部前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs分析及功能注釋

將分化0、2、4、6天的前脂肪細(xì)胞樣本進(jìn)行兩兩比較(A0?vs. A2；A0 vs. A4；A0 vs. A6；A2 vs. A4；A2 vs. A6和A4 vs. A6)得到了1,336個(gè)差異表達(dá)lncRNA和1,759個(gè)差異表達(dá)mRNA，在各個(gè)階段差異表達(dá)的基因(Differential expression, DEGs)的數(shù)量隨著細(xì)胞分化而下降(Figure 4)。3095個(gè)DEGs的GO分析結(jié)果顯示生物過程分類的前三個(gè)富集條目是細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞過程和電子傳遞鏈。在分子功能分類中前三個(gè)富集條目是轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白結(jié)合和核苷結(jié)合。在細(xì)胞組分類別中前三個(gè)富集條目是細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)和胞外區(qū)。通路分析結(jié)果顯示丙酸代謝、脂肪酸代謝，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解途徑被顯著富集。此外，通過k-means均值聚類，3,095個(gè)差異基因被聚成8個(gè)表達(dá)模式。其中，K2這一簇基因中在前脂肪細(xì)胞分化中起著重要作用。

Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs) at?different stages.

4. 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和模塊構(gòu)建

對3095個(gè)DEGs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出10個(gè)關(guān)聯(lián)模塊（figure 6B）。隨后對這些模塊進(jìn)行了基于特征向量基因的聚類分析，10個(gè)模塊被分為四組：第一是藍(lán)綠色模塊；第二：紅色，棕色，粉紅色的模塊；第三模塊，包括紫色和紅色；第四組為藍(lán)色，黑色，綠色，黃色的模塊（figure 6C）。屬于同一組的模塊可能具有相同或相似的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制。

Figure 6 Visualization of construction of the coexpression network.

5. 時(shí)期特異性模塊的鑒定和可視化

使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），鑒定了與A0（第0天），A2（第2天）和A6（第6天）階段相關(guān)的6個(gè)階段特異性模塊，這些模塊的表達(dá)模式可能在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用（figure 6B, D）。

6. 核心和高度相關(guān)基因的鑒定

在黑色、藍(lán)色、綠色和黃色四個(gè)高度相關(guān)的模塊中鑒定了五個(gè)共同的基因。這表明xloc_068731，xloc_022661，染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白6（CHD6），幼蟲巨大致死基因同源物1（llgl1），以及Neuralized?E3泛素蛋白連接酶1b（neurl1b）可能在A2分化階段扮演重要的角色。在棕色模塊，Kelch家族成員38（klhl38）和xloc_045161為高度相關(guān)的mRNA與lncRNA，表明其潛在的脂肪細(xì)胞分化調(diào)控作用在A6階段。肌動蛋白相關(guān)蛋白6同源物（actr6）和xloc_070302是A0時(shí)期與分化調(diào)節(jié)相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子（Figure 8）。

Figure 8 Visualization of connections of genes in various modules.

7. 階段特異性模塊基因的GO和通路分析

GO分析顯示，RNA代謝過程、調(diào)節(jié)定位、及細(xì)胞代謝過程均在A0期富集；前體代謝物質(zhì)和能量產(chǎn)生，電子傳遞鏈，有機(jī)物氧化的能量產(chǎn)生在A2階段高度富集；囊胚發(fā)育和細(xì)胞過程均在A6階段富集。在通路分析中， A0和A6階段沒有鑒定出顯著的通路。A0階段的前三個(gè)通路是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，溶酶體，和半乳糖代謝；而不飽和脂肪酸合成，細(xì)胞凋亡，和丙酸代謝是A6階段的前三個(gè)通路。A2階段氧化磷酸化被顯著富集。

8. RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

選取用于RNA-seq的樣本中的核心和高度相關(guān)基因XLOC_045161, XLOC_070302, XLOC_068731, XLOC_022661,ACTR6, CHD6, LLGL1和NEURL1B進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致（Figure 9）。

Figure 9 Validation of highly connected genes using RT-qPCR. *P ＜0.05, **P＜0.01.

結(jié)論：經(jīng)RNA-seq和篩選在雞前脂肪細(xì)胞中獲得了27,023個(gè)新的lncRNA。不同分化階段的前脂肪細(xì)胞兩兩比較總計(jì)鑒定出3095個(gè)DEGs，它們參與甘油脂代謝、mTOR、PPAR和MAPK信號通路。通過RT-PCR鑒定和驗(yàn)證了8個(gè)階段特異性模塊中的高度相關(guān)基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致。

創(chuàng)新點(diǎn)：

這項(xiàng)研究第一次分析了雞腹部脂肪前體細(xì)胞分化過程中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)。首次報(bào)道了一些與前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的通路，包括丙酸代謝，脂肪酸代謝和氧化磷酸化途徑，為進(jìn)一步研究雞的lncRNA提供了寶貴的資源，有利于更好的了解雞的前脂肪細(xì)胞分化。

 

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